T载体克隆常见问题

浏览:74 发表时间:2020-02-25 00:00:00

T载体克隆常见问题

1. 连接体系中T载体和PCR片段的含量

    一般市场上各种T载体的包装浓度为20-50ng/ul。常规3kb左右的T载体在连接体系中加入总量为50ng-100ng,载体和片段摩尔比一般为1 :3。比如,一个500bp片段连接到3kb的T载体中,T载体加入量60ng,则500bp片段应该为30ng。

2. PCR片段的质量

     连接体系中PCR片段的质量对连接成败起着关键作用。

1)PCR片段的长度不同对连接的要求也不同,过长或是较短的PCR片段需要调整连接体系;

2)PCR片段的纯度和特异性要较高;

3)回收后的PCR片段浓度要合适,特别是长度较长的片段,浓度不能过低,PCR产物做胶回收会降低片段浓度。

3. 平板没有菌斑或是很少

     收到T载体后,一般要-20℃保存。如果短期内不能使用完,建议将载体分装保存。在室温或是4℃放置过久,T载体会出现末端T丢失,载体降解等情况。

平板没有菌斑或是很少,除T载体损坏外,其它原因有:

1)连接体系中的连接酶及Buffer;

2)末端含A的PCR片段质量,包括纯度、浓度以及特异性;

3)感受态细胞的质量

4. 连接长度较短的PCR片段时,会出现菌斑过多,或是过少的情况

     在同样总量的情况下,DNA片段长度越短,其摩尔数就会越多,这也是许多小的PCR片段容易连接,长出更多菌斑的原因。如果DNA片段摩尔数过多,就会竞争结合有限的T载体,导致连接效率降低,反而会使菌斑降低。所以,对于连接该类片段时,其摩尔数不能过多。

5. 连接长度较长的PCR片段时,常会出现菌斑较少或不长斑等情况

     常规连接时,当PCR片段长度大于2kb时,一般菌斑就会出现下降趋势。PCR片段长度越大,菌斑就会越少。可以通过以下方法调试:

1)延长连接时间;

2)提高载体和片段的质量,比如,片段要为特异性单一条带,片段不能有降解趋势,载体和片段的纯度和浓度要高;

3)可以尝试调整载体和片段摩尔比,比如调整为1 :1等。


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