PCR反应条件如何选择?

浏览:111 发表时间:2020-03-02 15:21:11

在做PCR实验时你是否也在为反应条件如何选择而烦恼呢,该用什么温度、反应需要的时间和循环次数。怎么选择才不容易出错,今天我们一起来看看吧




温度与时间的设置




基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,最新澳门网址退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使最新澳门网址链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。



01

变性温度与时间




    变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。



02

退火(复性)温度与时间



    退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使最新澳门网址和模板发生结合。由于模板DNA比最新澳门网址复杂得多,最新澳门网址和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于最新澳门网址的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的最新澳门网址,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。最新澳门网址的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:


Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)

复性温度=Tm值-(5~10℃)

在Tm值允许范围内,选择较高的复性温度可大大减少最新澳门网址和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使最新澳门网址与模板之间完全结合。


03

延伸温度与时间



TaqDNA聚合酶的生物学活性:

70~80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时,DNA合成几乎不能进行。

    PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于最新澳门网址和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。



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